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過去10年間、遺伝子配列解析技術はがん研究と臨床現場で広く利用され、がんの分子特性を明らかにするための重要なツールとなっています。分子診断と標的治療の進歩は、腫瘍の精密治療の概念の発展を促進し、腫瘍の診断と治療の分野全体に大きな変化をもたらしました。遺伝子検査は、がんのリスクを警告し、治療決定を導き、予後を評価するために使用でき、患者の臨床転帰を向上させる重要なツールです。本稿では、CA Cancer J Clin、JCO、Ann Oncolなどのジャーナルに掲載された最近の論文を要約し、がんの診断と治療における遺伝子検査の応用について考察します。

体細胞変異と生殖細胞系列変異。一般的に、がんはDNA変異によって引き起こされますが、これらの変異は親から受け継がれる（生殖細胞系列変異）か、加齢とともに後天的に発生する（体細胞変異）可能性があります。生殖細胞系列変異は出生時から存在し、変異原は通常、体内のすべての細胞のDNAに変異を持ち、子孫に受け継がれます。体細胞変異は、個体が配偶子以外の細胞で獲得するもので、通常は子孫に受け継がれません。生殖細胞系列変異と体細胞変異はどちらも、細胞の正常な機能を破壊し、細胞の悪性化につながる可能性があります。体細胞変異は悪性腫瘍の主要な要因であり、腫瘍学において最も予測力の高いバイオマーカーです。しかし、腫瘍患者の約10～20%は、がんリスクを著しく高める生殖細胞系列変異を有しており、これらの変異の中には治療効果を持つものもあります。
ドライバー変異とパッセンジャー変異。すべてのDNA変異が細胞機能に影響を与えるわけではありません。平均して、正常な細胞変性を引き起こすには、「ドライバー変異」と呼ばれる5～10個のゲノムイベントが必要です。ドライバー変異は、細胞増殖制御、DNA修復、細胞周期制御、その他の生命活動に関与する遺伝子など、細胞の生命活動に密接に関連する遺伝子に発生することが多く、治療標的として利用できる可能性があります。しかし、あらゆるがんにおける変異の総数は非常に多く、乳がんでは数千個程度から、大腸がんや子宮内膜がんなど、非常に多様性に富むがんでは10万個を超えることもあります。ほとんどの変異は、たとえコード領域で発生したとしても、生物学的意義がないか、あるいは限定的です。このような重要性の低い変異イベントは「パッセンジャー変異」と呼ばれます。特定の腫瘍型における遺伝子変異が、治療への反応性または治療抵抗性を予測する場合、その変異は臨床的に手術可能とみなされます。
がん遺伝子と腫瘍抑制遺伝子。がんにおいて頻繁に変異する遺伝子は、大きく分けてがん遺伝子と腫瘍抑制遺伝子の2つのカテゴリーに分類できます。正常細胞において、がん遺伝子がコードするタンパク質は主に細胞増殖を促進し、細胞死を抑制する役割を果たします。一方、がん抑制遺伝子がコードするタンパク質は主に細胞分裂を抑制し、正常な細胞機能を維持する役割を担っています。悪性化過程においては、ゲノム変異によってがん遺伝子の活性が亢進し、がん抑制遺伝子の活性は低下または消失します。
小さな変異と構造変異。これらはゲノムにおける2つの主要な変異の種類です。小さな変異は、塩基の挿入、欠失、フレームシフト、開始コドンの欠失、終止コドンの欠失など、少数の塩基の置換、欠失、または追加によってDNAを変化させます。構造変異は、遺伝子コピー数の変化、染色体の欠失、重複、逆位、または転座など、数千塩基から染色体の大部分に及ぶ遺伝子セグメントを含む、大規模なゲノム再編成です。これらの変異は、タンパク質機能の低下または増強を引き起こす可能性があります。個々の遺伝子レベルでの変化に加えて、ゲノムシグネチャーも臨床シーケンスレポートの一部です。ゲノムシグネチャーは、腫瘍変異負荷（TMB）、マイクロサテライト不安定性（MSI）、相同組換え欠陥など、小さな変異および/または構造変異の複雑なパターンとして捉えることができます。

クローン変異とサブクローン変異。クローン変異はすべての腫瘍細胞に存在し、診断時だけでなく治療が進んだ後も存在し続けます。そのため、クローン変異は腫瘍の治療標的として利用できる可能性があります。サブクローン変異はがん細胞のサブセットにのみ存在し、診断初期に検出される場合もありますが、その後の再発時に消失するか、治療後に初めて出現します。がんの異質性とは、単一のがんに複数のサブクローン変異が存在することを指します。特に、一般的ながん種における臨床的に重要なドライバー変異の大部分はクローン変異であり、がんの進行を通じて安定しています。耐性は、多くの場合サブクローンによって媒介され、診断時には検出されない可能性がありますが、治療後の再発時に現れます。

従来の技術であるFISH法、すなわち細胞核型検査は、染色体レベルの変化を検出するために用いられます。FISH法は遺伝子融合、欠失、増幅の検出に用いることができ、高い精度と感度を有するものの、スループットが限られていることから、こうした変異検出における「ゴールドスタンダード」と考えられています。一部の造血悪性腫瘍、特に急性白血病では、核型検査は依然として診断と予後予測の指標として用いられていますが、この技術は徐々にFISH法、WGS法、NGS法などの標的分子アッセイに取って代わられつつあります。
個々の遺伝子の変化はPCR（リアルタイムPCRとデジタルドロップPCRの両方）によって検出できます。これらの技術は感度が高く、特に小さな残存病変の検出とモニタリングに適しており、比較的短時間で結果が得られます。欠点は、検出範囲が限られていること（通常は1つまたは少数の遺伝子の変異のみを検出）と、複数の検査を行う能力が限られていることです。
免疫組織化学（IHC）は、ERBB2（HER2）やエストロゲン受容体などのバイオマーカーの発現を検出するために一般的に用いられるタンパク質ベースのモニタリングツールです。IHCは、特定の変異タンパク質（BRAF V600Eなど）や特定の遺伝子融合（ALK融合など）の検出にも使用できます。IHCの利点は、日常的な組織分析プロセスに容易に統合できるため、他の検査と組み合わせることができることです。さらに、IHCは細胞内タンパク質の局在に関する情報も提供します。欠点は、拡張性が限られていることと、組織的な要件が高いことです。
第二世代シーケンシング（NGS）NGSは、ハイスループット並列シーケンシング技術を用いて、DNAレベルおよび／またはRNAレベルの変異を検出します。この技術は、全ゲノム（WGS）と関心のある遺伝子領域の両方のシーケンシングに使用できます。WGSは最も包括的なゲノム変異情報を提供しますが、新鮮な腫瘍組織サンプルが必要であること（WGSはホルマリン固定サンプルの解析にはまだ適していません）や高コストなど、臨床応用には多くの障害があります。
標的NGSシーケンシングには、全エクソンシーケンシングと標的遺伝子パネルが含まれます。これらの検査では、DNAプローブまたはPCR増幅によって対象領域をエンリッチメントすることで、必要なシーケンシングの量を制限します（全エクソンはゲノムの1～2%を占め、500遺伝子を含む大規模なパネルでさえゲノムのわずか0.1%を占めます）。全エクソンシーケンシングはホルマリン固定組織では良好な結果が得られますが、依然としてコストが高額です。標的遺伝子の組み合わせは比較的経済的で、検査する遺伝子を柔軟に選択できます。さらに、循環遊離DNA（cfDNA）は、がん患者のゲノム解析における新たな選択肢として浮上しており、液体生検として知られています。がん細胞と正常細胞の両方が血流中にDNAを放出する可能性があり、がん細胞から放出されたDNAは循環腫瘍DNA（ctDNA）と呼ばれ、これを分析することで腫瘍細胞の潜在的な変異を検出することができます。
検査の選択は、対処すべき具体的な臨床問題によって異なります。承認済みの治療法に関連するバイオマーカーのほとんどは、FISH、IHC、PCR法によって検出できます。これらの方法は少量のバイオマーカーの検出には適していますが、スループットの向上に伴う検出効率の向上にはつながりません。また、検出されるバイオマーカーが多すぎると、検出に必要な組織が不足する可能性があります。肺がんなど、組織サンプルの入手が困難で、検査対象となるバイオマーカーが複数ある特定のがん種では、NGSの使用がより適切な選択肢となります。結論として、検査法の選択は、各患者で検査するバイオマーカーの数と、そのバイオマーカーを検査する患者数によって異なります。乳がん患者におけるエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ERBB2の検出など、標的が特定されている場合は、IHC/FISHのみで十分な場合もあります。より包括的なゲノム変異の探索と潜在的な治療標的の探索が必要な場合は、NGSの方がより体系的で費用対効果に優れています。さらに、IHC/FISH の結果が曖昧または決定的でない場合には、NGS が考慮されることもあります。

遺伝子検査の対象となる患者については、様々なガイドラインが指針を示しています。2020年、ESMOプレシジョン・メディシン・ワーキンググループは、進行がん患者に対する初のNGS検査に関する推奨事項を発表し、進行非扁平上皮非小細胞肺がん、前立腺がん、大腸がん、胆管がん、卵巣がんの腫瘍サンプルに対する定期的なNGS検査を推奨しました。2024年には、ESMOはこの基準を更新し、乳がんおよび希少腫瘍（消化管間質腫瘍、肉腫、甲状腺がん、原因不明のがんなど）を検査対象に含めることを推奨しました。
2022年に発表されたASCOの転移性または進行癌患者における体細胞ゲノム検査に関する臨床意見では、転移性または進行固形癌患者においてバイオマーカー関連治療が承認された場合、これらの患者に対して遺伝子検査が推奨されるとされています。例えば、転移性黒色腫患者においては、RAF阻害剤およびMEK阻害剤がこの適応症で承認されているため、BRAF V600E変異をスクリーニングするためのゲノム検査を実施する必要があります。さらに、患者に投与する薬剤に対する明確な耐性マーカーがある場合にも、遺伝子検査を実施する必要があります。例えば、egfrmabはKRAS変異大腸癌には効果がありません。遺伝子シーケンスの適格性を検討する際には、患者の身体状態、併存疾患、腫瘍のステージを総合的に考慮する必要があります。なぜなら、患者の同意、検査室での処理、シーケンス結果の解析など、ゲノムシーケンスに必要な一連の手順には、患者が十分な身体能力と平均余命を有していることが求められるからです。
体細胞変異に加えて、一部のがんでは生殖細胞系列遺伝子の検査も行う必要があります。生殖細胞系列変異の検査は、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がんにおける BRCA1 変異や BRCA2 変異などのがんの治療決定に影響を及ぼす可能性があります。生殖細胞系列変異は、患者の将来のがんスクリーニングと予防にも影響を与える可能性があります。生殖細胞系列変異の検査に適している可能性のある患者は、がんの家族歴、診断時の年齢、がんの種類などの要因を含む特定の条件を満たす必要があります。ただし、生殖細胞系列に病原性変異を有する患者の多く (最大 50%) は、家族歴に基づく生殖細胞系列変異の検査の従来の基準を満たしていません。そのため、変異キャリアを最大限に特定するために、全米総合がんセンターネットワーク (NCCN) は、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、膵臓がん、大腸がん、前立腺がんのすべてまたはほとんどの患者に対して生殖細胞系列変異の検査を行うことを推奨しています。
遺伝子検査のタイミングに関しては、臨床的に重要なドライバー変異の大部分はクローン性であり、癌の進行過程を通じて比較的安定しているため、進行癌の診断時に患者に遺伝子検査を実施することが合理的です。その後の遺伝子検査、特に分子標的療法後の検査では、腫瘍組織DNAよりもctDNA検査の方が有利です。これは、血中DNAにはすべての腫瘍病変のDNAが含まれている可能性があるため、腫瘍の異質性に関する情報を得るのに有利だからです。
治療後のctDNA解析は、標準的な画像診断法よりも早期に腫瘍の治療反応を予測し、疾患の進行を特定できる可能性があります。しかし、これらのデータを治療方針の決定に用いるためのプロトコルは確立されておらず、臨床試験以外ではctDNA解析は推奨されません。ctDNAは、根治的腫瘍手術後の微小残存病変の評価にも使用できます。術後のctDNA検査は、その後の疾患進行の強力な予測因子であり、患者が補助化学療法の恩恵を受けるかどうかを判断するのに役立つ可能性がありますが、臨床試験以外でctDNAを補助化学療法の決定に用いることは依然として推奨されていません。

データ処理 ゲノムシーケンシングの最初のステップは、患者サンプルからDNAを抽出し、ライブラリを準備し、生のシーケンシングデータを生成することです。生データは、低品質データのフィルタリング、参照ゲノムとの比較、様々な解析アルゴリズムによる様々な変異の識別、これらの変異がタンパク質翻訳に及ぼす影響の判定、生殖細胞系列の変異のフィルタリングなど、さらなる処理が必要です。
ドライバー遺伝子アノテーションは、ドライバー変異とパッセンジャー変異を区別するために設計されています。ドライバー変異は、腫瘍抑制遺伝子の活性の喪失または増強につながります。腫瘍抑制遺伝子の不活性化につながる小さなバリアントには、ナンセンス変異、フレームシフト変異、主要なスプライシング部位の変異、および頻度の低い開始コドン欠失、終止コドン欠失、およびさまざまなイントロン挿入/欠失変異が含まれます。さらに、ミスセンス変異や小さなイントロン挿入/欠失変異も、重要な機能ドメインに影響を及ぼす場合、腫瘍抑制遺伝子の活性の喪失につながる可能性があります。腫瘍抑制遺伝子の活性の喪失につながる構造バリアントには、部分的または完全な遺伝子欠失や、遺伝子の読み枠の破壊につながるその他のゲノムバリアントが含まれます。がん遺伝子の機能強化につながる小さなバリアントには、重要なタンパク質機能ドメインを標的とするミスセンス変異や時折のイントロン挿入/欠失が含まれます。まれに、タンパク質の切断またはスプライシング部位の変異ががん遺伝子の活性化につながることがあります。がん遺伝子の活性化につながる構造変異には、遺伝子融合、遺伝子欠失、遺伝子重複などがあります。
ゲノム変異の臨床的解釈は、同定された変異の臨床的意義、すなわち、それらの潜在的な診断的価値、予後価値、または治療的価値を評価するものです。ゲノム変異の臨床的解釈を導くために使用できる、エビデンスに基づくグレーディングシステムがいくつかあります。
メモリアル・スローン・ケタリングがんセンターのプレシジョン・メディシン腫瘍学データベース（OncoKB）は、薬剤使用の予測値に基づいて遺伝子変異を4つのレベルに分類しています。レベル1/2は、FDA承認済みまたは臨床標準バイオマーカーであり、承認済み薬剤に対する特定の適応症への反応を予測します。レベル3は、FDA承認済みまたは未承認のバイオマーカーであり、臨床試験で有望な結果を示した新規標的薬剤への反応を予測します。レベル4は、FDA未承認のバイオマーカーであり、臨床試験で説得力のある生物学的エビデンスを示した新規標的薬剤への反応を予測します。治療抵抗性に関連する5番目のサブグループが追加されました。
米国分子病理学会（AMP）/米国臨床腫瘍学会（ASCO）/米国病理専門医協会（CAP）の体細胞変異の解釈に関するガイドラインでは、体細胞変異を4つのカテゴリーに分類しています。グレードI（強い臨床的意義あり）、グレードII（潜在的な臨床的意義あり）、グレードIII（臨床的意義不明）、グレードIV（臨床的意義が不明）です。治療方針の決定において有用なのは、グレードIとグレードIIの変異のみです。
ESMO の分子標的臨床操作性スケール (ESCAT) では、遺伝子変異を 6 つのレベルに分類しています。レベル I は日常的な使用に適した標的です。フェーズ II は現在も研究中の標的であり、標的薬の恩恵を受けられる患者集団をスクリーニングするために使用される可能性が高いですが、それを裏付けるにはより多くのデータが必要です。グレード III は、他の癌種で臨床的利点が実証されている標的遺伝子変異です。グレード IV は、前臨床証拠によって裏付けられている標的遺伝子変異のみです。グレード V では、変異を標的とすることの臨床的意義を裏付ける証拠がありますが、標的に対する単剤療法では生存期間が延長されないか、併用治療戦略を採用できます。グレード X は、臨床的価値がありません。